Op 27 augustus 1585 valt Antwerpen opnieuw in Spaanse handen. Op het kasteel van Beveren tekent de protestantse burgemeester Marnix van Sint-Aldegonde de overgave. Grote delen van de bevolking, vooral (protestantse) kooplui en intellectuelen vertrekken naar het Noorden.
Zowel de koning van Frankrijk als de Koningin van Engeland (Elisabeth) weigeren de soevereiniteit over de opstandige provincies te aanvaarden. Uiteindelijk neemt Engeland toch de Nederlanden in bescherming. Robert Dudley, graaf van Leicester, wordt met een troepenmacht van 6.000 man naar de Nederlanden gestuurd. De zoon van Willem van Oranje, prins Maurits, is even voordien tot stadhouder van Holland en Zeeland benoemd. Leicester laat zich uitroepen tot landvoogt maar Elisabeth gelast hem die titel op te geven omdat zij een oorlog met Spanje wil vermijden. Vanaf februari 1586 regelt Johan van Oldenbarnevelt, landsadvocaat van Holland, de interne zaken binnen de Unie. De graaf van Leicester behoudt de leiding over de militaire operaties. De kleurrijke graaf komt echter al snel in conflict met de Staten van Holland, die alles in het werk stellen om zijn macht te beperken. In 1587 vertrekt de graaf. Er worden geen verdere pogingen ondernomen om een vorst te vinden en de Republiek der Verenigde Nederlanden is een feit.
Filips II bereidt ondertussen een grootscheepse onderneming voor tegen Engeland. Hij wil het land herwinnen voor het katholieke geloof en met koningin Elisabeth afrekenen wegens haar hulp aan de Nederlanden. In 1588 vaart Filips met een grote vloot, de Armada, naar het noorden. De onderneming loopt op een drama uit voor de Spanjaarden. In juli wordt een groot deel van de Armada vernietigd en de overgebleven schepen besluiten via Schotland en Ierland terug te varen naar Spanje. Door de stormen en stromingen worden nogmaals een groot aantal schepen vernietigd.
Breda is al sinds 1581 in handen van de Spanjaarden. De schipper Adriaen van Bergen uit Leur brengt al jaren turf naar het kasteel van Breda. Hij benaderd stadhouder Maurits met het voorstel om soldaten in zijn turfschip mee te smokkelen. Op 3 maart 1590 varen zeventig soldaten de slotgracht binnen. Rond middernacht bestormen ze het kasteel en de Spanjaarden geven zich over. De verovering van Breda is het eerste militaire succes na de dood van Willem van Oranje.
In 1596 wordt een drievoudig verbond gesloten tussen de Nederlanden, Engeland en Frankrijk waarin de Republiek erkent wordt. Engeland, dat samen met de Republiek de Spaanse Armada verslagen heeft, wil meer macht op de wereldzeeën. En Frankrijk heeft weinig belang bij een Spaans gezag aan de noordgrens. Dit is een groot succes voor Johan van Oldenbarnevelt. Veel militaire waarde heeft het verbond echter niet. In 1598 sluit Frankrijk vrede met Spanje. Engeland in 1604.
In 1598 schenkt Filips II de Nederlanden als een onafhankelijke staat aan zijn dochter Isabella en haar man, aartshertog Albertus van Oostenrijk. Vanzelfsprekend erkent de noordelijke helft hen niet. Er wordt een poging ondernomen om de provinciën te verenigingen maar tevergeefs. Filips II overlijdt in datzelfde jaar.
In juni 1600 besluiten de (Noordelijke) Staten-Generaal, op aandringen van Johan van Oldenbarnevelt, dat Duinkerke aan de Vlaamse kust moet worden ingenomen. Dit omdat het een uitvalsbasis is van piraten die de handelsvloot bedreigen. Overwacht ontmoet het leger van Maurits een Spaans leger op het strand bij Nieuwpoort. De slag wordt gewonnen maar het leger raakt dermate verzwakt dat Maurits direct terugkeert naar het Noorden.
Omdat de kosten van de oorlog tegen Spanje erg hoog oplopen wil raadspensionaris Johan van Oldenbarnevelt vrede. Albert, de hertog van de Zuidelijke Nederlanden, ziet hier wel heil in. Op 9 april 1609 wordt in Antwerpen een Twaalfjarig bestand getekend. Tot 1621 stopt het geweld waardoor de Republiek uit haar financiele misere kan opkrabbelen. Er onstaat echter een nieuw godsdienstig en politiek conflict. Rond 1610 ontstaan in de protestantse kerk in Nederland twee stromingen rond de Leidse hoogleraren Arminius en Gomarus. Zij twisten over de leer van de voorbeschikking. De gomaristen menen dat God alles al heeft vastgelegd, maar de arminianen kennen de mens een vrije wil toe. De arminianen vragen in een remonstratie (verzoekschrift) de Staten van Holland om bescherming. Prompt sturen de gomaristen een contraremonstrantie, die erop neerkomt dat de Staten zich nergens mee mogen bemoeien.
De remonstranten waren republikeins. Johan van Oldenbarnevelt koos partij voor hen. Prins Maurits koos partij voor de contra-remonstranten. Op 29 augustus 1618 pleegt Maurits een staatsgreep. Hij laat van Oldenbarnevelt en diens medestander Hugo de Groot arresteren. Een partijdige rechtbank veroordeelt van Oldenbarnevelt op 12 mei 1619 ter dood wegens hoogverraad. Een dag later wordt hij op een schavot op het Binnenhof in den Haag onthoofd. Hugo de Groot wordt veroordeeld tot levenslange opsluiting op Slot Loevestein.
Op Slot Loevestein krijgt hij in een grote boekenkist telkens nieuw leesvoer. In maart 1621 verstopt zijn vrouw Maria van Reigersbergh hem in deze boekenkist en smokkelt hem naar buiten. Verkleed als metselaar vlucht Hugo naar Parijs.
Prins Maurits wordt in deze tijd de belangrijkste figuur in de Republiek. In 1621 overlijdt Albertus van Oostenrijk. Omdat zijn huwelijk met Isabella kinderloos is gebleven komen de Zuidelijke Nederlanden weer onder Spaans bestuur waardoor de strijd tussen de Spaanse troepen en de Republiek weer oplaaien. Op 23 april 1625 overlijdt prins Maurits. Zijn halfbroer Frederik Hendrik volgt hem direct op als prins van Oranje. Frederik Hendrik is minder star dan zijn broer en heeft veel meer allure. Hij trouwt met Amalia van Solms en het echtpaar leidt een weelderig hofleven. Grote kunstenaars uit zijn tijd zoals Rembrandt krijgen opdrachten. Ook laat hij de paleizen Noordeinde en Huis ten Bosch bouwen.
De hervatting van de strijd verloopt aanvankelijke niet gunstig voor de Republiek. Zo valt Breda in handen van de Spanjaarden. Frederik Hendrik is echter een geducht veldheer en boekt verschillende successen. In 1628 verovert de zeerover Piet Hein voor de Cubaanse kust in naam van de Republiek de Spaanse Zilvervloot: plotseling is er geld in overvloed. In 1629 wordt Den Bosch ingenomen door Frederik Hendrik.
In 1633 probeert Isabella (na de dood van haar man aangebleven als landvoogdes) op eigen gezag vrede te sluiten met de Republiek. De onderhandelingen lopen echter op niets uit en Isabella overlijdt nog datzelfde jaar. Op 4 november 1634 wordt Ferdinand van Oostenrijk de nieuwe landvoogd van de Zuidelijke Nederlanden. In 1635 verovert hij de steden Sierck-les-Bains en Trier waarop Frankrijk de oorlog verklaard aan Spanje. De Franse troepen verslaan de Spanjaarden in de Slag bij les Avins. Samen met het leger van de Republiek veroveren ze ook enkele steden in de Zuidelijke Nederlanden. Op 8 februari sluiten kardinaal Richelieu namens Frankrijk en Frederik Hendrik namens de Republiek een verdrag om de Waalse Nederlanden bij Frankrijk en de Vlaamse Nederlanden bij de Republiek te voegen. Dit verdrag werd echter niet van kracht omdat Frederik Hendrik zich uit argwaan terug trok.
In 1639 ondernemen de Spanjaarden een tweede poging om met een armada de zeemacht van de Republiek te breken. Deze tweede armada wordt echter door Maarten Harpertszoon Tromp verslagen in de Slag bij Duins.
In 1647 komt Frederik Hendrik te overlijden. Hij wordt opgevolgd door stadhouder Willem II. De landvoogd van de zuidelijke Nederlanden wordt aartshertog Leopold van Oostenrijk.
Inmiddels is het oorlog in grote delen van Europa, de Dertigjarige Oorlog. In 1641 beginnen de vredesonderhandelingen tussen de strijdende partijen. Hoewel de Republiek niet meevocht in de Dertigjarige Oorlog slaagde de Republiek er toch in als volwaardige staat aan de onderhandelingen mee te mogen doen.
In 1648 tekenen Spanje en de Republiek een vredesverdrag in het stadhuis te Munster. Spanje erkent de Republiek als zelfstandige staat en de Republiek hoeft geen concessies te doen in geloofskwesties. De Vrede van Munster betekent het einde van de Tachtigjarige Oorlog.